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【论文题名】 活化动员亲缘间HLA半相合异基因单个核细胞治疗恶性实体瘤的基础和临床实验研究
【 作  者 】 任秀宝
【指导老师】 郝希山
【学位类别】 博士
【授予学位日期】 20060606
【授予学位单位】 天津医科大学
【关键词】 实体瘤;抗肿瘤效应;母胎微嵌合;基因移植;混合嵌合;晚期转移
【分类号】 R730.5;R73-37
【摘要种类】 中文文摘
【 摘  要 】 第一部分:活化动员的亲缘间HLA半相合异基因单个核细胞治疗晚期转移或化疗抵抗性实体瘤初步观察 目的:初步探讨活化动员的亲缘间HLA半相合异基因单个核细胞治疗晚期转移性/化疗抗性实体瘤的可行性。方法:11例晚期转移性/化疗抵抗性恶性实体瘤患者,供者为与患者HLA半相合直系亲属。供者经10μg/kg·dG-CSF动员3天后采集haplo-HSCs,体外用大剂量rhIL-2培养激活4h后回输患者。观察治疗后临床反应;采用流式细胞仪、LDH和ELISA试剂盒检测动员、活化前后表型,IL-2短期活化前后的非特异性杀瘤活性以及患者回输前后血清中各种细胞因子的含量变化。结果:11例患者回输的单个核细胞总数达(2.5~4.3)×1010。经G-CSF动员后T细胞,尤其是CD4+T细胞显著下降,而NK细胞比例显著上升;经大剂量IL-2短期活化后,活化细胞(包括CD69+和CD25+细胞)亚群比例显著升高。体外实验中可观察到IL-2短期活化的单个核细胞具有类似LAK样的较高的非特异性杀瘤活性。经过治疗,11例患者血清中Th1类细胞因子,如IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α含量明显升高,而Th2类细胞因子,如TGF-β含量明显下降。治疗后8例观察到临床症状的缓解,或肿瘤标志物的降低,或影像学资料的改善,其中1例治疗后4月时达到临床PR,1例在治疗后9月达到MR,2例无效,截至1年随访期结束时共有6例患者仍病情稳定,而有5例死亡。结论:IL-2短期活化的HLA半相合的单个核细胞具有明显的抗肿瘤效应,为治疗晚期转移性/化疗抗性实体瘤提供了新的希望。 第二部分:供受者之间母胎微嵌合促进活化的HLA半相合异基因单个核细胞抗肿瘤效应目的:探索供受者之间母胎微嵌合状态对活化HLA半相合异基因单个核细胞抗肿瘤活性的影响。方法:选取30例进行活化的HLA半相合异基因单个核细胞治疗的实体肿瘤患者,提取供者基因组DNA,利用HLA-DRB通用引物扩增HLA-DRB位点第二外显子,扩增产物稀释100倍后作为模板,采用PCR-SSP方法进行低分辨率的HLA-DR配型。PCR产物经电泳鉴定是否存在母胎微嵌合。对母胎微嵌合状态不同的患者,利用FISH和STR-PCR方法比较接受治疗后供者细胞在患者体内的停留时间,利用ELISA法比较不同时间点患者血清中Th1/Th2类细胞因子的浓度。结果:提取基因组DNA的纯度可达(1.843±0.136),浓度为(213.7±116)ng/μl。利用HLA-DR通用引物可特异性扩增出272bp的PCR产物,经2%琼脂糖电泳鉴定无异常杂带。巢式PCR-SSP法灵敏度较高,特异性较好,在母子/母女移植患者中的检出率为40%,而在父女/父子移植和兄弟姐妹移植中的检出率均为0,与文献报道一致。同时观察到存在母胎微嵌合的患者在接受供者细胞治疗后3月仍能检测到供者细胞,并且血清中Th1类细胞因子的浓度维持较高浓度的时间明显延长。结论:供受者之间的母胎微嵌合状态有利于提高活化HLA半相合异基因单个核细胞的抗肿瘤疗效。 第三部分:供受者混合嵌合有助于提高活化MHC半相合供者淋巴细胞的抗肿瘤效应目的:通过建立小鼠MHC半相合异基因移植肺癌复发模型比较供受者混合嵌合对活化DLI的体内外抗肿瘤活性的可能影响。方法:利用不同剂量照射(9gy和6.5gy)对小鼠进行清髓性或非清髓性的预处理,建立小鼠MHC半相合异基因移植模型,并接种亲本来源肺癌细胞建立移植后复发模型。分别比较清髓性和非清髓性异基因移植下活化DLI的体内分布特点,体内外抗肿瘤活性,以及不同程度供者嵌合对DLI抗肿瘤活性的影响。结果:9gy照射可以实现完全清髓,在3天内骨髓和脾脏中的有核细胞显著降低至几近于零,而6.5gy照射不会产生清髓作用,骨髓和脾脏中的有核细胞经过7天可恢复至治疗前水平。清髓性移植组可以形成稳定的完全供者嵌合,而非清髓性移植组只能实现供受者混合嵌合,并且供者嵌合率随时间延长而逐渐下降,在1月内降至5%以下。单纯MHC半相合异基因移植可以显著抑制肿瘤生长,虽然明显延长小鼠生存时间,但无法实现荷瘤鼠长期存活。接受活化DLI治疗后,当观察时间延长至19天时,该组肿瘤体积比接受自体来源活化淋巴细胞治疗组显著缩小近1倍,肿瘤局部病理显示有较多淋巴细胞聚集,LDH法检测该组小鼠脾脏细胞具有更强的特异性杀伤活性。比较高嵌合率(供者嵌合率22%)和低嵌合率(供者嵌合率10%)的供受者混合嵌合组与完全供者嵌合组肿瘤生长无明显区别。清髓性和非清髓性MHC半相合异基因移植鼠模型中活化DLI在体内各实质脏器中的分布具有相同的趋势,并且放射性计数相差无多。结论:供受者混合嵌合是保证MHC半相合活化DLI治疗产生强GVT的前题,它可通过非清髓性移植短期获得,并可能通过在受者体内形成供者特异性免疫耐受而发挥作用。
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