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【论文题名】 基于LCM技术的人子宫内膜癌相关基因的筛选、克隆与鉴定
【 作  者 】 刘文欣
【指导老师】 郝希山
【学位类别】 博士
【授予学位日期】 20060606
【授予学位单位】 天津医科大学
【关键词】 激光捕获显微切割;子宫内膜癌;荧光差异显示;免疫组织化学;基因差异表达;抑癌基因
【分类号】 R737.33
【摘要种类】 中文文摘
【 摘  要 】 第一部分激光捕获纤维切割与微量RNA的提取、纯化、浓缩 目的:摸索一条可行的技术路线,运用激光捕获显微切割(LCM)技术获取无间质混杂的人正常子宫内膜腺管上皮细胞与子宫内膜癌细胞,用于进行子宫内膜癌相关基因差异表达的研究。 方法:采用LCM技术分别从正常子宫内膜组织及子宫内膜癌组织冰冻切片中捕获子宫内膜腺管上皮细胞及子宫内膜癌细胞,提取微量RNA,并对微量RNA进行纯化及浓缩。设立对照实验鉴定微量RNA的完整性,分光光度计检测RNA的浓度。 结果:分别从冰冻切片中捕获子宫内膜腺管上皮细胞280,000shootings,捕获子宫内膜癌细胞196,000shootings。对照实验Ⅰ、Ⅱ证实经LCM后RNA完整性较好。确定了LCMshooting次数与可获得RNA量间对应关系。 结论:通过LCM技术可以从冰冻切片中捕获单一类型的目的细胞,此过程不会造成细胞RNA明显降解,可以应用于下游的实验研究。 第二部分人子宫内膜癌相关基因cDNA片段的筛选、克隆与鉴定 目的:筛选、克隆与鉴定人子宫内膜癌发病相关基因片段,探索子宫内膜癌发生的分子机制。 方法:采用荧光差异显示技术(FDD-PCR)比较LCM捕获细胞提取的正常子宫内膜腺管细胞RNA与子宫内膜癌细胞RNA,筛选与子宫内膜癌发病特异相关的差异基因片段,克隆测序后反向Northern点杂交(使用扩增的RNA)验证差异片段的真假,对阳性片段利用Genebank进行BLAST比对分析。 结果:共获得38条差异条带,3条在正常子宫内膜中高表达,35条在子宫内膜癌中高表达。对10条再回收差异条带进行克隆并测序,经反向Northern点杂交鉴定获得6条阳性差异基因片段。经BLAST比对分析发现:L1.1与细胞周期蛋白依赖性激酶7(CDK7)同源性为99%;L1.9与人类蛋白磷酸酶1调节抑制亚单位12A(PPP1R12A)同源性为99%;L1.21和L1.22与E1A激活基因1的抑制子(CERG)同源性为100%;L1.25、L1.26与锌转运家族中的10号锌转运体(SLC39A10)同源性为98%以上。 结论:通过LCM技术与FDD-PCR技术的结合,获得了与子宫内膜癌发病特异相关的基因片段。首次从基因水平发现了CDK7、PPP1R12A、CERG、SLC39A10与子宫内膜癌发病的相关性,补充了对子宫内膜癌发病的分子机理的认识。其中CDK7、CERG、SLC39A10可以作为新的子宫内膜癌候选癌基因,PPP1R12A可以作为新的子宫内膜癌候选抑癌基因来进行进一步更深层次的研究。 第三部分CDK7蛋白表达与人子宫内膜癌临床特点的相关性研究 目的:研究CDK7在子宫内膜癌组织中的蛋白表达情况及与子宫内膜癌临床特点的关系。 方法:采用免疫组化染色技术检测CDK7在47例子宫内膜癌组织中的表达情况,以10例正常子宫内膜组织为对照研究并进行统计学分析。 结果:CDK7在子宫内膜癌中的表达率(74.5%)明显高于其在正常子宫内膜中的表达率(10.0%)(P<0.05)。CDK7蛋白表达与肌层侵润深度及组织学分级无明显关系(P>0.05)。 结论:CDK7与子宫内膜癌发病明显相关,可以作为子宫内膜癌潜在的分子标志物进行进一步研究。
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