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  学位论文详细信息  
【论文题名】 乳腺癌骨转移早期事件的探讨
【 作  者 】 张会来
【指导老师】 郝希山
【学位类别】 博士
【授予学位日期】 20060606
【授予学位单位】 天津医科大学
【关键词】 乳腺癌;骨转移;早期事件;速激肽;间充质干细胞
【分类号】 R737.9;R73-37
【摘要种类】 中文文摘
【 摘  要 】 背景:乳腺癌是女性中常见的恶性肿瘤。骨骼是乳腺癌常见的远处转移部位之一,高达70-80%的乳腺癌可发生骨转移。由于骨转移可以引起病理性骨折和剧烈的骨痛,严重影响患者的生存质量,而常规化、放疗和手术又不能延长晚期乳腺癌骨转移患者的生存期,因此,深入研究乳腺癌骨转移的分子和细胞学机制,特别是骨转移早期的分子机制对于早期诊断并综合各种手段有效控制骨痛和减少骨相关事件的发生,有着重要的临床意义。 目前乳腺癌骨转移的确切分子机制还不清楚。当前研究认为骨干骺端血管结构与肿瘤细胞的粘附、肿瘤细胞向血管外浸润与骨基质的粘附、肿瘤细胞与骨细胞及骨髓微环境的交互作用等方面在骨转移的发生、发展过程中可能起着重要的作用。但由于缺乏合适的动物模型和骨组织结构的复杂性,使肿瘤特异性骨转移的机制研究受限。 随着神经科学的发展,越来越多的研究发现,神经肽及神经递质不仅参与支配局部组织的生理活动,它还可以通过与细胞膜表面的特异性受体结合进行信号传导,进而对靶细胞分化、生长、代谢、细胞骨架结构、基因表达产生影响。其中,神经肽及神经递质对肿瘤增殖和分化的调控作用、调控机理及肿瘤细胞表面神经肽受体的表达与肿瘤浸润及转移的密切关系正日益受到研究者的注意。为此,本课题研究了前速激肽原(preprotachykinin-I,PPT-I)及速激肽受体NK-1和NK-2在乳腺癌中的表达及其在乳腺癌增殖中的作用,并初步探讨了它们在乳腺癌骨转移早期事件中的可能作用机制,为进一步揭示乳腺癌骨转移的分子机制,进而为骨转移的预防、早期诊断以及制定合理有效的综合治疗方案提供重要的理论依据。 第一部分:PPT-I、NK-1和NK-2在乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中的表达目的:研究PPT-I、NK-1和NK-2在乳腺癌及其癌旁组织以及乳腺癌细胞系T-47D、MCF-7和正常乳腺上皮细胞系HBL-100中的表达,探讨PPT-I、NK-1和NK2的表达与乳腺癌的恶性生物学行为之间的关系。 方法:首先通过免疫组化技术检测了37例乳腺癌及其癌旁组织以及乳腺癌细胞系T-47D、MCF-7和正常乳腺上皮细胞系HBL-100的PPT-I、NK-1和NK-2的表达。然后采用实时荧光定量PCR和Westernblot检测了乳腺癌细胞系T-47D,MCF-7,MDA-MB-435,以及正常乳腺上皮细胞系HBL-100的PPT-I、NK-1和NK-2的mRNA和蛋白表达。 结果:乳腺癌组织NK-1、NK-2和PPT-I的阳性表达率分别为83.8%、81.1%和86.5%,而癌旁组织三个指标的表达率分别为18.8%、75%和21.9%,两者比较乳腺癌组织的NK-1和PPT-I的表达率明显高于癌旁组织(p<0.01),而NK-2的表达两者差别不大。PPT-I和NK-1在3个乳腺癌细胞系呈高表达,在正常乳腺上皮细胞HBL-100中呈低表达,而NK-2表达在几个细胞系中没有明显差异。 结论:PPT-I和NK-1的表达可能与乳腺癌的恶性增殖和浸润能力有关。 第二部分:NK-1和NK-2受体拮抗剂对乳腺癌细胞系T-47D的增殖的影响目的:通过研究NK-1和NK-2受体拮抗剂对于乳腺癌细胞系T-47D增殖的影响,进一步探讨速激肽生物网络在乳腺癌恶性增殖中的重要作用。 方法:将乳腺癌细胞系T-47D分为四个组,即空白对照组、NK-1受体拮抗剂组、NK-2受体拮抗剂组和NK-1、NK2受体拮抗剂联合用药组,分别采用克隆形成实验和细胞生长周期检测的方法,观察用药后四个组的细胞增殖情况。 结果:加入NK受体拮抗剂后,乳腺癌细胞的克隆形成被明显地抑制,但在同时加入两种拮抗剂的实验组并没有完全阻断其增殖,仍然看到了乳腺癌细胞的生长,这提示我们乳腺癌细胞可能还同时存在其它的途径促进其生长。同时我们通过流式细胞仪对细胞增殖周期的检测中发现,加入拮抗剂后,大量细胞被阻滞在了S期和G0/G1期,而没有进入G2/M期进行分裂增殖。 结论:速激肽受体NK-1和NK-2在乳腺癌细胞系T-47D生长中的具有重要作用,提示乳腺癌细胞可能存在速激肽的自分泌和旁分泌作用,通过这些作用可以促进自身的增殖。 第三部分PPT-I、NK-1和NK-2的表达与乳腺癌骨转移之间相互关系的探讨目的:探讨PPT-I基因、速激肽受体NK-1和NK-2的表达与乳腺癌骨转移之间可能存在的相关关系。 方法:将乳腺癌细胞系T-47D与正常成人骨髓间充质干细胞(MSC)等量混合培养,分别在混合培养后48小时和96小时,采用免疫磁珠阳性分选的方法,从共培养体系中分离出T-47D细胞,分别采用realtime-PCR检测混合前后T-47D细胞PPT-I、NK-1和NK-2的mRNA表达变化;western-blot检测混合前后T-47D细胞PPT-I、NK-1和NK-2的蛋白表达的变化;利用透射电镜观察混合前后T-47D超微结构的变化;流式细胞仪检测T-47D增殖周期的变化;以及混合培养后T-47D细胞的生长曲线的变化。 结果:与骨髓间充质干细胞混合培养后T-47D细胞的增殖明显减慢,细胞周期也发生了改变,大量细胞被阻滞在了S期,而没有进入G2/M期进行分裂增殖,类似于一种接触性抑制的状态。电镜超微结构的观察也证实了混合培养后T-47D细胞遗传物质合成的增加,但同时却出现了大量糖原颗粒的堆积,提示我们混合后T-47D细胞的增殖受到明显抑制。与MSC混合培养96小时后,T-47D细胞的PPT-I的蛋白及mRNA表达明显发生了上调,而NK-1和NK-2的mRNA和蛋白表达明显下降。 结论:乳腺癌细胞在骨转移早期很可能是通过前速激肽原基因PPT-I的表达上调而获得在骨髓基质中的生存,同时它所表现的接触性抑制的状态很可能是通过下调速激肽受体基因NK-1和NK-2的表达水平来实现的。
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