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【论文题名】 GM-CSF基因修饰同种异体肺癌细胞系制备瘤苗治疗肺癌的实验研究
【 作  者 】 姜宏景
【指导老师】 郝希山
【学位类别】 博士
【授予学位日期】 20060610
【授予学位单位】 天津医科大学
【关键词】 肺癌;疫苗;免疫治疗;化疗;基因转染;动物实验
【分类号】 R730.58;R734.2
【摘要种类】 中文文摘
【 摘  要 】 第一部分基因转染小鼠肺癌细胞系瘤苗的构建和鉴定 目的:构建GM-CSF基因修饰的小鼠肺癌细胞系(LLC和LA795)瘤苗,并鉴定其在肿瘤细胞的表达。方法:RT-PCR法扩增小鼠GM-CSF基因,将目的基因GM-CSF连入pMD18-T载体,并对重组质粒进行扩增与鉴定。以测序正确的重组质粒为模板扩增目的基因,并将其连接到pIRES2-EGFP载体,构建重组GM-CSF-pIRES2-EGFP载体。利用该质粒转染小鼠肺癌细胞系制备肿瘤疫苗,ELISA法检测转染后肺癌细胞GM-CSF蛋白的分泌。结果:(1)经测序证实RT-PCR正确扩增了小鼠GM-CSF基因;(2)经酶切鉴定证实GM-CSF-pIRES2-EGFP重组质粒合成正确(3)重组质粒GM-CSF-pIRES2-EGFP转染获得表达GM-CSF基因的小鼠肺癌细胞;(4)转染后的小鼠肺癌细胞经ELISA法鉴定有相应GM-CSF蛋白表达,表达量适合制备肿瘤疫苗。结论:(1)成功构建表达GM-CSF的重组pIRES2-EGFP质粒;(2)转染后的小鼠肺癌细胞能够表达足够的GM-CSF的蛋白,且功能正常,成功制备小鼠肺癌细胞瘤苗。 第二部分GM-CSF分泌性全细胞肿瘤疫苗的动物实验及免疫机制研究 目的:探讨表达GM-CSF的小鼠肺癌细胞(自体和同种异体)制备肿瘤疫苗的抗肿瘤作用和机制。方法:(1)分成预防组、治疗组和化疗组。预防组和治疗组分为分泌性自体和同种异体瘤苗组、自体和同种异体瘤苗组、PBS对照组;化疗组分为分泌性自体和同种异体瘤苗+化疗组、单纯化疗组;(2)预防组在预防接种后,接种LLC,观察成瘤时间、成瘤后生存时间、ELISA检测小鼠外周血细胞因子的变化、流式细胞法检测检测外周血细胞亚群、脾细胞杀伤实验、ELISPOT实验、接种部位免疫组化等;(3)治疗组在接种LLC,成瘤后,给予不同的瘤苗接种治疗,观察上述指标;(4)化疗组在接种LLC成瘤后,给予低剂量卡铂化疗,3天后给予不同的瘤苗接种治疗,观察上述指标。结果:(1)各组实验证实在GM-CSF分泌性全细胞肿瘤疫苗接种后能够激发机体的免疫应答,主要为CD8+T细胞的增殖和活化,流式细胞检测、杀伤实验和ELISOPT实验也能证实,CD4+T细胞的应答不明显;外周血Th1类细胞因子增加明显,Th2类无明显变化,免疫抑制类细胞因子在多次接种后增加;(2)预防组在GM-CSF分泌性全细胞肿瘤疫苗接种后,小鼠的成瘤时间明显晚于其它各组,生存期也长于其它各组;(3)治疗组的生存期各组之间无明显差异;(4)化疗组的生存期明显好于单纯化疗和单纯免疫组;(5)GM-CSF分泌性的自体瘤苗效果稍好于同种异体瘤苗,但无统计学差异。结论:GM-CSF分泌性自体或同种异体瘤苗具有抗特异性肿瘤的作用,能够强化肿瘤的免疫功能,提高机体抗肿瘤的免疫反应,抑制肿瘤生长,延长生存时间。同种异体瘤苗的免疫效果与自体瘤苗的免疫效果基本近似,由于其在制备过程中的巨大优势,使其有可能成为制备肿瘤疫苗的重要方法。瘤苗免疫治疗结合化疗显示出良好的前景,为联合化免治疗提示了非常值得期望的前景。
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